如何降低“高风险”宿主细胞蛋白带来的风险

由BioPhorum

宿主细胞蛋白(HCPs)是过程相关的杂质，可能与生物制药产品共纯化。其中一些是有问题的，可能被认为是高风险的，包括那些具有免疫原性、生物活性或酶活性的，可能会降解制剂中使用的产品分子或赋形剂。有些已经被证明很难通过净化去除。

目前已知的HCP直接影响患者安全的案例很少，那么生物制药行业为什么要担心这些高风险HCP呢?我们可以采取什么方法来了解它们共同化的起源，并解决这些高风险的hcp ?

为了回答这些问题，生物论坛发展集团(BPDG) HCP工作组在其26家公司团队中发起了一项合作，围绕高风险HCP建立行业联盟。结果是一篇全文引用的论文“高量宿主细胞蛋白(HCPs):一种多重量公司合作的观点，本文对此进行了总结。

HCP工作流程建立在以前的跨行业小组的基础上，这些小组对评估HCP杂质和发展对监管机构要求的共同理解提出了建议。

一个子团队还进行了文献搜索，以了解高风险HCPs的影响，并讨论成员公司的经验。这些重点是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产的生物药物，并通过Protein a亲和柱和额外的抛光步骤纯化。

下游加工中常见的HCPs

CHO表达系统是生物制药生产中最常见的哺乳动物系统之一，因为它能够产生与人类相似的翻译后修饰的复杂蛋白质。已经确认了6000多个CHO hcp。

下游加工通常包括蛋白A亲和纯化，然后是进一步去除聚集物、电荷变异、HCPs和宿主细胞DNA的额外抛光步骤。对Protein A色谱后的HCPs进行的文献检索显示，在生物制药行业中发现了许多相同的HCPs。尽管CHO细胞系、上游过程或下游过程存在差异，但鉴定出的HCPs相似。

研究小组从已发表的文献中汇编了这些常见HCPs的列表，可用于参考在不同处理步骤中发现的HCPs。这些都在BioPhorum文件的一个表格中完整列出，其中提供了分子量、pI、氨基酸的数量，以及每个蛋白质与Uniprot数据库的直接链接。参见表1中的摘录。

表1:在不同处理步骤中发现的常见HCPs的综合列表(仅摘录)

曹蛋白质	分子量(kDa)	pl	UniProt加入。	不。氨基酸的
40S核糖体蛋白SA	19．7	9．4	G3HQX0	179
60S酸性核糖体蛋白P0	30.6	8．9	G3HKG9	280
78 kDa葡萄糖调节蛋白(GRP78, BiP)	72.4	5．1	G3I8R9	654
胞质肌动蛋白1 (ACTB)	41．7	5．2	P48975	375
α-烯醇酶应承担的高磷量区域(2 D还是甘油酸酯hydro-lyase)	15．5	5．0	G3I0W1	139

biohorum的HCP搜索数据库将继续更新常见的HCPs及其特征(见表2)。不同HCPs的身份可能对公司在开发下游工艺或可能精炼现有净化平台时具有指导意义。

表2:仅常见HCPs - cathepsin CHOs数据库提取

曹蛋白质	UniProt加入。	分子量(kDa)	pl	不。氨基酸的
组织蛋白酶B (CatB)	G3H0L9	37.5	5．7	339
组织蛋白酶D (CatD)	G3I4W7	44.1	6．5	408
组织蛋白酶E(美食)	G3HAY9	42.2	4．7	388
组织蛋白酶L (CatL)	G3INC5	37.3	6．8	333
组织蛋白酶Z(卡茨)	Q9EPP7	34	7．5	306

分类的学校

将有问题的HCP归类为免疫原性高风险或低风险是很困难的。风险取决于许多因素，包括药物适应证、给药途径、给药频率和每次给药剂量的HCP量。

将有问题的HCP归类为高风险的方法可能是基于HCP与产品共纯化的能力，其在下游加工中的出现频率，其修饰或降解药物和/或赋形剂的能力，以及其免疫原性的潜力。

利用这种方法，HCPs可以根据其潜在影响分为四大类:产品质量、配方、对人体的直接生物学功能和免疫原性。通过广泛的文献搜索和HCP工作流程的工作经验，我们编制了一份高危HCP清单，并根据它们的影响进行了分类(这些列表列在BioPhorum出版物和数据库中的一个表中)。

HCP工作流程调查结果

经过全面的文献检索和BPDG团队讨论，团队被调查以了解有问题或高风险hcp的成员公司的集体经验。主要调查结果的摘要如下:

1. 69%的公司表示，他们在药品生产过程中遇到过单个hcp的问题。
2. 磷脂酶B‐like 2是识别/检测和检测后清除反应最高的HCP。其他被鉴定的HCPs包括脂蛋白脂肪酶、组织蛋白酶(D、B和L)和溶酶体磷脂酶A2。大多数答复者表示，他们能够显示出这些hcp的清除情况。
3. 大多数公司使用HCP特异性的质谱(MS)或酶联免疫吸附法(ELISAs)来识别和测量单个HCP。较少的受访者使用酶/活性分析，只有一人表示使用凝胶切除后再用液相色谱-质谱分析。
4. 大多数被调查者使用一种或多种HCP ELISA方法进行释放检测，定量药物中的总HCP，少数使用MS定量、陀螺和中尺度发现等技术。
5. 大多数受访者使用MS进行过程开发支持;也有人将其用于临床和非临床原料药/药品样品。此外，64%的公司使用相对量化，其余使用绝对量化。
6. 67%的受访者在分析前没有对HCPs进行富集，17%进行了富集，其余使用沉淀。在消化方法上，13家公司使用胰蛋白酶，4家公司使用胰蛋白酶+赖氨酸C。
7. 45%的公司表示，他们没有收到关于总HCP和单个HCP分析测试策略的监管反馈;36%的人说他们有。其余的人说，要求进行2D报道是作为监管反馈的一部分。

行业的建议

在确定的HCP及其对过程或患者的影响之间建立联系可能是具有挑战性的。因此，工业界必须建立一个全面的分析策略，以适当地测量已知的HCP杂质，如果确定为高风险，则制定一个控制策略来监测和/或消除这些杂质。为达致上述目标而提出的建议如下:

1. 开发总HCP免疫分析所需的关键试剂应该仔细生成和描述。
2. 针对工艺特异性HCPs的关键抗体试剂应使用额外的正交方法进行评估，如2D凝胶/western和/或抗体亲和提取，然后MS。
3. 总HCP ELISA应常规进行，以确定过程样品中的HCP水平。
4. 建议采用正交法和/或单独的HCP检测方法，以确保产品纯度。
5. 如果个体HCP被识别并被认为具有潜在高风险:
   1. 为了更好地了解HCP水平及其潜在影响，可能需要开发一种监测已知杂质的特异性免疫分析方法或靶向质谱分析方法。
   2. 如果鉴定出的杂质具有酶活性，则可以开发活性分析来指导工艺和产品开发，以监测、去除和/或使蛋白质失活。
   3. 免疫原性评估可以通过硅内方法进行，如果硅内预测表明免疫原性风险高，则进行体外比较免疫原性评估。
   4. 毒理学输入可能是有价值的评估临床风险。

HCP的检测、定量和从最终的生物治疗过程中去除可能是复杂的。biohorum的高危或有问题的HCPs列表可以为开发CHO细胞生物治疗药物的公司提供资源。它将它们分为四个主要类别根据其对产品质量的影响,制定,直接在人类生物功能,和免疫原性(见表3)。如果一个HCP高危险名单被确定在一个过程中,企业应该遵循推荐行动,执行风险评估,并建立一个HCP控制策略。

表3:高量风险hcp根据其影响进行分类(仅摘录)

蛋白质的名字	函数	影响	类型的影响	选择引用
葡萄糖调节蛋白(GRP78;毕普)	内质网管腔的蛋白质折叠和质量控制	药品质量	聚合的药物	法雷尔等人，2015;Liu et al.， 2019;瓦伦特等人，2015年
α应承担的烯醇酶	催化2‐磷酸甘油酸脱水成磷酸烯醇丙酮酸	药品质量	修改的药物	瓦伦特等人，2015;Zhang et al.， 2014
膜联蛋白A5 (ANXA5)	与磷脂具有高亲和力，可作为细胞凋亡的标志物	免疫原性	免疫原性反应	Fukuda et al.， 2019;Gilgunn & Bones, 2018年
C‐X‐C基序趋化因子3 (CXCL3)	具有潜在致癌特性的细胞因子	人体生物学功能	免疫原性反应	Gilgunn & Bones, 2018;Gilgunn等人，2019年
羧酸酯酶(CEB)	催化裂解含酯或酰胺的底物成醇和羧酸	配方	聚山梨醇酯的降解	McShan等人，2016;Zhang et al.， 2020

每个公司在产品和工艺开发过程中可能会遇到独特的情况，必须在逐个案例的基础上进行HCP风险评估。我们希望这次合作将指导行业有针对性的高风险HCP鉴定，并主动降低生物制品中这些HCP带来的风险。